一、将蛋白质组学质谱数据转化为见解

1、综合学习管理

进行复杂的蛋白质组学实验需要能够将数据文件映射到实验研究条件，以组织和理解结果。Proteome Discoverer软件使用内置的研究设计功能来分配定性和定量变量。该研究允许选择数据文件，将数据文件与量化方法相关联，创建实验变量作为研究因素，并将研究因素映射到数据文件和量化通道。每个数据文件或分割数据文件的集合可以映射到一个或多个研究因素，然后用于进行比较和统计分析。

2、预定义和可自定义的处理工作流

蛋白质组发现者软件工作流程系统由一个基于节点的架构组成，该架构可以以线性或分支路径连接，以最大限度地增加从蛋白质组数据集收集的信息量。该工作流程系统允许新用户快速轻松地部署TMT、LFQ、PTM鉴定和交联肽鉴定的预定义工作流程，并为专家用户组装高级工作流程以分析最复杂的蛋白质组学数据集提供灵活性。光谱被引入到工作流程的顶部，并通过执行过滤、肽识别、量化、错误发现率（FDR）计算、PTM位点定位、生物信息学分析等的节点

共识工作流程增加了额外的分组和验证步骤以及生物解释。蛋白质注释节点将结果表添加到具有通路注释和GO和Pfam注释的蛋白质组中，用于内置生物信息学分析，如富集。

还可以使用脚本节点自定义工作流以运行可执行文件，从而将自定义脚本的结果直接集成到Proteome Discoverer软件结果中。

3、强大的数据处理工作流程，适合先进的仪器采集策略

蛋白质组学实验可能需要多种片段类型来为给定的研究生成必要的信息。Proteome Discoverer软件支持用于MS2或MSn数据的所有Orbitrap质谱仪碎片化方法，包括高能碰撞解离（HCD）、碰撞诱导解离（CID）、电子转移解离（ETD）、电子传递高能碰撞离解（EThcD）、紫外光解（UVPD），质子转移电荷减少（PTCR）及其组合。使用Thermo Scientific发现更多肽和蛋白质™用于识别和定量的FAIMS Pro Duo接口。

使用扫描事件筛选器和多个搜索引擎为具有交替CID和ETD碎片的多个MSn模式自定义工作流，以改进注释。使用同步前体选择MS3（SPS MS3）和Sequest实时搜索辅助TMT SPS MS3部署最有信心的TMT量化策略™HT和INFERYS Restoring、CHIMERYS智能搜索算法或Comet，并使用Reporter Ions Quantifier节点进行量化。使用MS2和MS3信息来鉴定和量化具有XlinkX节点的交联肽。使用ProSightPD软件，结合UVPD、ETD、EThcD、HCD、CID和PTCR，以最佳序列覆盖率进行自上而下的蛋白质组学。使用Sequest HT和IMP ptmRS识别具有多阶段激活和EThcD的大多数PTM。

二、人工智能赋予的全面搜索能力

通过重新构想串联质谱分析对蛋白质组学数据进行更深层次的挖掘

1、用人工智能实现嵌合谱的反褶积

新的CHIMERYS智能搜索算法利用人工智能从头开始重新思考串联质谱的分析。CHIMERYS通过深度学习结合强大的去卷积算法提供准确的肽谱和保留时间预测，克服了混合肽MS2谱的挑战。这种革命性的方法导致了对数据的更深入挖掘，并大大增加了在依赖数据的采集数据中发现的PSM的数量。与以前的策略相比，CHIMERYS在每个串联质谱中发现了更多的PSM，并显著提高了识别率，更少的光谱没有返回PSM，许多光谱返回三个或更多PSM。与其他方法相比，这导致在典型蛋白质组学数据集中鉴定和量化的独特肽和蛋白质的数量显著提高。

三、不仅仅是软件——宽窗口采集

使用带有CHIMERYS的Proteome Discoverer软件优化仪器采集方法

蛋白质组学样品的数据依赖性采集传统上利用狭窄的分离窗口来减少多个肽的共分离，这是由于搜索引擎去卷积嵌合谱的能力受到限制。与这些传统约束相比，CHIMERYS智能搜索算法利用人工智能从头开始重新思考串联质谱的分析，以实现复杂嵌合光谱的去卷积，并实现新的数据采集策略。采用更宽的前体隔离窗口进行MS2数据采集，再加上使用CHIMERYS进行数据处理，可以大大提高Orbitrap/Orbitrap和Orbitrap/离子阱采集方法的性能。使用Orbitrap采集MS2数据提供了最大的改进，隔离宽度在2-4 Th之间，离子阱数据采集平台在1.5 Th左右。优化的数据采集和处理策略的配对提供了协同效益，通过每个收集的串联质谱同时裂解更多的肽和对所得嵌合光谱进行去卷积来提高仪器利用率，从而用芯片准确解释所得数据的复杂性

1、使用INFERYS Restoring提高搜索结果的可信度

为了提高Sequest HT肽鉴定的可信度，基于INFERYS Rescoring深度学习的模型计算所有目标和诱饵命中的所有预测光谱，并计算预测光谱和测量光谱相关性的优值。

INFERYS Rescoring生成的这些额外信息被添加到FDR阈值的Percolator计算中。与其他方法相比，这导致在典型蛋白质组学数据集中鉴定和定量的独特肽和蛋白质的数量有所提高

虽然INFERYS Rescoring提供的额外置信度增加了所有蛋白质组学应用中已鉴定和定量的蛋白质的数量，但它为单细胞蛋白质组学、元蛋白质组学和免疫肽组学提供了特定的益处。通过包括碎片离子强度的度量，INFERYS Rescoring可以根据经典分数识别难以与诱饵分离的目标。

碎片离子强度的精确预测能够计算基于强度的分数，这增加了对结果的信心。INFERYS Rescoring提供的额外信心对于免疫肽组学来说尤其重要，因为那里有巨大的搜索空间和许多具有相似特性的非常相似的肽。例如，在来自患者来源的黑色素瘤细胞系免疫肽组学研究的HLA I类数据集中，与单独的Sequest HT相比，INFERYS Rescoring提供了58%的PSM增加和55%的肽鉴定增加。当使用非常低的蛋白质负载导致低丰度MS2光谱时，例如单细胞蛋白质组学时，INFERYS Rescoring也增加了鉴定的可信度。通过添加额外的优值，可以挽救可能被遗漏的肽，以提高覆盖率，并识别和量化每个样本中更多的蛋白质和肽。与单独使用Sequest HT相比，这导致肽ID增加15-20%。

2、将搜索引擎与可扩展框架混合匹配

Proteome Discoverer软件的可扩展框架允许灵活的工作流程和多个搜索引擎的部署。Sequest HT是默认的搜索引擎，用于在串联质谱中识别肽。Sequest HT评估来自所提供数据库的蛋白质序列，并计算在给定前体信息的情况下可能存在的肽的列表。Sequest HT计算该候选肽列表的理论串联质谱，并将理论光谱与实验光谱进行比较，以产生用于排序的Xcorr分数。除了Sequest HT，Proteome Discoverer软件还提供了一系列第三方搜索引擎。

四、无标签量化工作流

1、全面的量化能力

Proteome Discoverer软件使LFQ分析具有全面的功能。单个或多维分离都可以通过添加文件或分数来使用。预定义的LFQ工作流程支持所有Orbitrap质谱仪，并支持使用FAIMS Pro Duo接口生成的数据。Minora特征检测器节点检测并量化MS1data中的同位素簇，然后将簇映射到所有数据文件中工作流中使用的搜索引擎中的PSM。Proteome Discoverer软件还使用一种独特的比率和p值计算方法，通过使用成对比率方法来产生准确的比率，以及使用“背景”蛋白质分布来确定是否有任何单个蛋白质差异表达的p值计算。为了帮助LFQ结果的可视化和过滤，该软件还包括可视化和统计分析工具，如丰度图和热图，可直接连接到动态过滤和绘图的结果。

2、利用人工智能识别和量化更多蛋白质和肽

LFQ工作流程可以利用CHIMERYS智能搜索算法或Sequest HT与INFERYS Rescoring来识别和量化更多蛋白质。通过深入挖掘数据以识别更多的肽，CHIMERYS与Minora特征检测器配对，可以量化更多的肽和蛋白质。类似地，使用Sequest HT将INFERYS Restoring添加到工作流程中，将INFERYS Restoring对每个目标和诱饵命中的预测光谱与产生这些PSM的实验碎片谱进行比较，从而增加了优值。Percolator利用这些信息进一步分离真实匹配与随机匹配的分布，以产生更多识别和量化的肽和蛋白质。

3、集成的统计分析和可视化工具

Proteome Discoverer软件内置的统计分析和可视化工具允许对结果进行快速过滤、可视化和解释。LFQ结果包括色谱图、主成分分析（PCA）图、热图、量化通道图等。定量通道图可以快速显示给定肽或蛋白质组在不同实验变量中的变化，并与色谱图轨迹相结合，以可视化所有条件下的检测峰。

在具有包含不同蛋白质表达的样本的应用中，如单细胞蛋白质组学，可以使用多变量工具（如PCA图和层次聚类热图）快速可视化复杂的数据集。这些图是高度互动的，使得选择和过滤区分群体的肽或蛋白质组变得容易。

例如，热图和PCA图可用于对单细胞蛋白质组学数据中的不同细胞类型进行分类。

五、等压质量标记（TMT和TMTpro）标记的肽定量

1、将智能数据采集策略与复杂的数据分析相结合，最大限度地提高洞察力

TMT和TMTpro试剂允许蛋白质组学样品的多路复用，并具有强大和有效的衍生作用，以获得更好的定量准确性和精密度。Proteome Discoverer软件提供默认的TMT方法来匹配各种试剂，以提供最准确和精确的结果。Proteome Discoverer软件提供预定义的工作流程来支持所有Orbitrap质谱仪，能够进行基于MS2和MS3的定量，并能够定制工作流程以增加已识别和定量的肽和蛋白质的数量。TMT蛋白质定量是使用来自肽到蛋白质水平值的信号到噪声相加的蛋白质丰度来进行的，以提高定量准确性和精密度的置信度。通过使用池或控制通道进行扩展，支持具有多个运行的较大数据集。

结果可以很容易地可视化和过滤，并且可以使用Scripting Node进行自定义，例如集成MSstatsTMT R库。

2、TMT和TMTpro结果的可视化

跨不同组复用样本可以提供广泛的信息，但可能需要使用多变量可视化来识别相似性和差异性。

例如，八种不同的人类细胞系在有和没有托林刺激的情况下的比较产生了通过相似性进行的聚类，可以通过内置的PCA和热图图图进行可视化。通过研究管理与内置可视化相结合，将研究因子和样本结合在一起，可以提供组间的明确区分，HCT116和RKO以及HeLa和Panc1由于细胞系的相似性而聚集在一起。

3、使用Comet搜索引擎匹配实时搜索辅助TMT SPS MS3结果

实时搜索辅助TMT SPS MS3功能使用彗星搜索引擎，基于前一MS2扫描中PSM的识别，智能触发MS3扫描，以提高准确性，增加定量蛋白质的数量，并提供无干扰光谱。Comet搜索引擎已添加到Proteome Discoverer软件框架中，以更紧密地匹配采集过程中识别的肽，并可单独或与其他搜索引擎一起用于处理数据。

4、改进TMT工作流程的识别和信心

将人工智能功能添加到TMT工作流程中，可以进行额外的识别和更自信的量化。在基于MS2的TMT工作流程中使用CHIMERYS智能搜索算法将提供用于量化的肽不是来自嵌合谱的信心，这将导致量化错误。CHIMERYS和INFERYS Rescoring也可以通过深入挖掘数据来帮助提高已识别和定量的肽和蛋白质的数量。

六、数据可视化

Proteome Discoverer软件为结果解释提供了直观的界面，包括数据表和绘图之间的特殊连接，以实现快速解释、过滤和可视化，从而更快地得出结果。

1、肽视图

使用嵌套表显示结果，其中PSM以交互方式直接连接到独特的肽、蛋白质和注释的MSn光谱。

这允许在表格、图表、光谱和色谱图之间进行动态过滤和连接，以便进行更彻底的调查和解释。

2、翻译后修改的识别和可视化

了解蛋白质的功能不仅需要鉴定未修饰的肽序列，还需要PTM的定位和存在。蛋白质组发现者软件框架包括IMP-ptmRS搜索节点，该节点使用由主搜索引擎确定的肽序列，考虑所有可能的位置异构体来计算残基的质量，识别和检测诊断片段离子，对命中率进行评分，并计算每个PTM的定位概率。3此外，Proteome Discoverer软件包括化学修饰表和修饰对话框，可轻松注释中性损失和/或诊断离子的串联质谱中的额外峰值。这种独特的功能简化了感兴趣的PTM的分析和解释。可以通过Mascot节点使用容错搜索来收集进一步的见解。

连接的修饰位点、肽异构体和PSMs表可用于在复杂的蛋白质组学数据中寻找差异表达的PTMs。

3、深入了解数据

Proteome Discoverer软件提供了与原始数据和数据处理结果相关的多种绘图功能。有关原始数据的信息可用于优化样品制备或采集策略，也可用于故障排除。分布图可以显示具有散点图、直方图和条形图的任何度量。例如，缺失裂解的数量可以显示在条形图中以确认全蛋白消化，或者Xcorr值的直方图可以用于显示哪些PSM通过FDR阈值滤波器，或者使用不同裂解技术的鉴定肽的比较可以用Venn图看到。这些回顾性分析有助于更全面地了解数据的生成和处理，从而推进明智的决策，部署优化的样本制备、采集和处理策略，以实现最佳的数据质量和结果

4、综合统计分析工具

解释大型蛋白质组学实验的结果需要能够将研究因素和样本映射到相关的统计测试和比率生成中，并具有灵活的过滤和可视化能力来确定相关的实验结果。Proteome Discoverer软件允许研究因子变量的层次结构来处理生物因子、实验分类因子和技术复制。为了提供最佳的定量和定性结果，可以在基于蛋白质丰度或成对比率的蛋白质比率计算的同时进行归一化和缩放。统计分析可以用t检验进行。还可以使用火山图来可视化结果，以显示具有可调节P值和log2倍变化值的蛋白质或肽的成对比较，从而基于所需变化进行选择和过滤

5、注释和路径映射

除了肽和蛋白质的鉴定和定量外，Proteome Discoverer软件还提供了结果的生物学解释。将“蛋白质注释”节点添加到共识工作流程中会创建“路径蛋白质组”和“注释蛋白质组”结果表。此外，可以从火山图、主成分分析图和热图中选择蛋白质，以生成富集表，显示代表性过高或代表性不足的途径、GO和Pfam术语，从而快速将结果转化为生物学见解。注释服务会定期更新，以提供最新的术语。该服务还允许下载完整的蛋白质组FASTA文件，并允许在数据库中修改条目时随时间轻松更新。

Proteome Discoverer 3新功能

安装激活教程

Proteome Discoverer应用程序是一个客户端-服务器应用程序，使用工作流处理和报告质谱数据。它将从质谱分析中获得的原始数据与选定FASTA数据库中的信息进行比较，并从串联质谱中识别肽。您可以使用此应用程序来分析所有赛默科学和其他质谱仪的质谱数据。具体而言，该应用程序执行各种操作，如肽识别搜索引擎，如Sequest HT和Mascot，以处理从低和高质量精度质谱（MS）仪器收集的所有数据类型。从各种解离方法和串联质谱的数据依赖阶段产生互补数据。以及组合、筛选和注释来自多个数据库搜索引擎和多个分析迭代的结果等。诸多强大的技术和算法以及智能便捷的功能，让专业认识能够自由灵活的深入探索研究，获得可视化的结果，详细的数据和报告，可视化结果，更容易理解和方便后期使用！